簡(jiǎn)介

生物制藥生產(chǎn)，由于其復(fù)雜的非線性性質(zhì)，充滿了無數(shù)的工藝變化，這些變化可能會(huì)影響藥物的安全性和有效性。自從二十多年前引入工藝表征和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) (DoE) 等概念以來，生物制藥行業(yè)在揭示工藝如何影響產(chǎn)品方面已經(jīng)創(chuàng)造并展示了相當(dāng)多的專業(yè)知識(shí)。然而，原材料 (RM) 的作用在某種程度上被忽視了，因此已成為工藝性能和產(chǎn)品質(zhì)量可變性的主要來源。從ICH Q8指南中可以明顯看出，原材料在過程控制策略中的作用越來越重要，該指南建議在“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)”(QbD)框架中，制造商必須了解包括原材料在內(nèi)的所有可變性來源。

(資料圖片僅供參考)

生物制藥生產(chǎn)中使用的原材料來源多種多樣，包括用于細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)酵的培養(yǎng)基成分，用于純化和化學(xué)修飾過程的精細(xì)化學(xué)品，以及用于最終藥品制劑的賦形劑。它們還包括產(chǎn)品接觸材料，如一次性塑料袋中使用的塑料。原材料的可變性可能來自于材料的化學(xué)或物理特性的變化。這種可變性會(huì)影響藥品的特性和質(zhì)量，并可能影響藥品的安全性、穩(wěn)定性和有效性。有時(shí)，這會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的不良事件，甚至導(dǎo)致藥物召回。例如，在過去幾年中，藥品中玻璃顆粒的存在導(dǎo)致了20多個(gè)產(chǎn)品的召回，包括Procrit和Epogen注射劑的召回。

原材料可變性的類型

原材料的可變性可以細(xì)分為三大類。第一類包括通過直接修飾或通過催化修飾 (如過氧化物、醛、還原糖和催化活性金屬離子) 改變生物治療藥物質(zhì)量的微量雜質(zhì)。第二類由微量雜質(zhì)組成，這些雜質(zhì)本身對(duì)人體有毒，如鉛和鋁。第三類包括微生物污染物 (及其相關(guān)的內(nèi)毒素)，它們導(dǎo)致原材料的生物負(fù)荷發(fā)生變化，并可能導(dǎo)致患者產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫反應(yīng)。每一個(gè)都需要它們自己的監(jiān)視和控制方法。

可變性的來源

用于生產(chǎn)重組蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)工藝使用復(fù)雜的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。雖然一些細(xì)胞可以在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生產(chǎn)而不需要添加物，但大多數(shù)細(xì)胞需要添加多達(dá)100種成分，如激素、生長(zhǎng)因子、維生素、肽、氨基酸和水解物來生長(zhǎng)。自然源性的培養(yǎng)基可含有大量化合物。它們還含有微量營(yíng)養(yǎng)素。

由于幾個(gè)原因，可變性可能在培養(yǎng)基中蔓延。培養(yǎng)基中存在的原料、雜質(zhì)和污染物的降解；大批量生產(chǎn)中，由于微量營(yíng)養(yǎng)素的損失，導(dǎo)致研磨和混合不均勻；由于可用性的限制，含量水平的不一致和原材料采購(gòu)的變化會(huì)導(dǎo)致原材料的可變性。雖然在過去的十年中已經(jīng)轉(zhuǎn)向使用化學(xué)限定的培養(yǎng)基，但天然培養(yǎng)基繼續(xù)被行業(yè)使用，并繼續(xù)為保持一致的產(chǎn)品質(zhì)量提供挑戰(zhàn)。即使是化學(xué)限定的培養(yǎng)基也有復(fù)雜的組成，這就需要對(duì)其進(jìn)行表征、以達(dá)到一致的工藝性能。

賦形劑質(zhì)量不一致會(huì)對(duì)藥品質(zhì)量產(chǎn)生不良影響。賦形劑源性的污染物可分為以下幾類：微量金屬、過氧化物、醛類、還原糖/多元醇和有機(jī)酸。這些賦形劑的純度水平可能會(huì)有很大差異，并在不同程度上影響產(chǎn)品的質(zhì)量/穩(wěn)定性。即使是純賦形劑，在儲(chǔ)存過程中也可能通過各種降解途徑而產(chǎn)生污染物。例如，聚山梨酸酯會(huì)發(fā)生自氧化，從而影響生物制藥產(chǎn)品的穩(wěn)定性。容器/封閉系統(tǒng)的析出物已被證明對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量有重大影響，最近的一些問題證明了這一點(diǎn)：玻璃小瓶中的玻璃薄片、預(yù)填充注射器中的鎢、小瓶塞或預(yù)填充注射器桶中的硅、過濾器中的析出物以及灌裝泵溶液接觸表面的納米顆粒脫落。層析填料的批次間差異也可能導(dǎo)致產(chǎn)量或產(chǎn)品質(zhì)量的意外變化。

基于QbD的原材料管理方法

國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議 (ICH) 在其Q7良好生產(chǎn)規(guī)范、Q8藥物開發(fā)、Q9質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和Q10藥品質(zhì)量體系指南中對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量提出了嚴(yán)格的要求。現(xiàn)行的原料分析方法在ICH Q7指南中有描述。該文件指出，用于制備活性藥物成分 (小分子和生物制劑) 的材料需要在收到時(shí)確認(rèn)每個(gè)批次的標(biāo)識(shí)，并提供供應(yīng)商提供的分析證書 (CoA)。藥典和處方專著，如USP/NF、EuP、JP和BP，為最常見和廣泛使用的材料提供了標(biāo)準(zhǔn)化的測(cè)試方法。制造商采用各種方法來測(cè)試原材料的合規(guī)性。一些公司通過對(duì)原材料供應(yīng)商進(jìn)行初步詳細(xì)的供應(yīng)商審核，然后根據(jù)藥典各論對(duì)三批原材料進(jìn)行年度鑒定，從而對(duì)原材料供應(yīng)商進(jìn)行質(zhì)量確認(rèn)。如果合格批次測(cè)試成功，那么隨后的材料出貨將只需要各論鑒定測(cè)試。然而，對(duì)原材料放行采取更為保守的方法的公司要求對(duì)每批供應(yīng)的材料進(jìn)行全面的專著測(cè)試。此外，根據(jù)對(duì)供應(yīng)商設(shè)施的審核，供應(yīng)商必須是合格的，其分析結(jié)果必須是可靠的，并且每種來料都需要一個(gè)抽樣計(jì)劃。

圖1. 在QbD范式中管理原材料

一個(gè)關(guān)鍵的挑戰(zhàn)是用于生物制藥生產(chǎn)的相對(duì)較大的原材料數(shù)量 (通常＞ 100)。為了有效地處理如此大量的原材料，已經(jīng)提出了一種基于QbD的多步驟方法 (圖1)。建議在產(chǎn)品開發(fā)的每個(gè)主要里程碑 (動(dòng)物試驗(yàn)、I期、II期、III期和驗(yàn)證) 進(jìn)行這種評(píng)估。雖然第一次執(zhí)行時(shí)是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)，但由于大多數(shù)原材料在同類產(chǎn)品 (例如單克隆抗體) 中是相同的，因此在接下來的時(shí)間內(nèi)工作量大大減少：

對(duì)工藝中使用的所有原材料進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。有許多不同的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工具，其細(xì)節(jié)和復(fù)雜性各不相同，重要的是要使用適合評(píng)估目的的方法。適當(dāng)?shù)纳姹姡绻に囬_發(fā)、生產(chǎn)、質(zhì)量保證和質(zhì)量控制，都包括在這個(gè)評(píng)估中。團(tuán)隊(duì)討論原材料是否有可能影響工藝性能，是否有可能影響產(chǎn)品質(zhì)量。那些可能影響兩者的被稱為關(guān)鍵原材料，那些只影響工藝過程而不影響產(chǎn)品的被稱為重要原材料，那些預(yù)計(jì)不會(huì)影響任何一方的被稱為非關(guān)鍵原材料。

然后，關(guān)鍵原材料被徹底表征，其與過程相互作用的機(jī)制被很好地理解。制造商應(yīng)該了解原材料是如何影響生產(chǎn)過程和產(chǎn)品的。需要識(shí)別可用于表征這種影響的原材料屬性，并建立這些屬性的可接受標(biāo)準(zhǔn)。需要開發(fā)分析測(cè)試來監(jiān)控這些屬性，以確保每個(gè)關(guān)鍵原材料批次在使用前符合各自的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。

重要原材料的表征可以與關(guān)鍵原材料相同，但關(guān)鍵原材料對(duì)每個(gè)產(chǎn)品都要進(jìn)行這種分析，而重要原材料需要對(duì)一個(gè)平臺(tái)進(jìn)行一次表征分析。每次將新的重要原材料添加到平臺(tái)上，在使用前都會(huì)對(duì)其進(jìn)行徹底的表征。

非關(guān)鍵原材料包括剩余 (和大部分) 原料，并通過生物制藥制造商的內(nèi)部質(zhì)量體系進(jìn)行處理，就像傳統(tǒng)制藥一樣。

評(píng)估可變性的工具

基于原材料如何影響工藝過程和產(chǎn)品質(zhì)量的詳細(xì)表征的原材料指紋為上述難題提供了一個(gè)潛在的解決方案。便于對(duì)原料質(zhì)量進(jìn)行高效且有效的監(jiān)控，防止對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生重大不利影響。

分析工具

對(duì)原材料的評(píng)估涉及到使用廣泛的分析技術(shù)，如光譜、色譜和基于酶的工具。光譜技術(shù)是快速的，并已被證明可以相當(dāng)有效的監(jiān)測(cè)原材料質(zhì)量中的變化，因此是首選的工具。拉曼光譜、近紅外光譜(NIR)、傅里葉變換紅外光譜(FTIR)、中紅外光譜(MIR)、熒光光譜和核磁共振 (NMR) 已被用于原材料的鑒定和表征。研究人員最近評(píng)估了幾種光譜技術(shù)用于檢測(cè)生物制藥制劑中常用的兩種賦形劑 - 三甲胺(Tris) 和鹽酸三甲胺(Tris- HCL) 的摻假的能力和適用性。對(duì)近紅外(NIR)、拉曼(手持式拉曼和拉曼顯微鏡)、傅里葉變換紅外(FTIR)和核磁共振(NMR)進(jìn)行了評(píng)估，并在分析速度和區(qū)分摻假和未摻假樣品的能力方面強(qiáng)調(diào)了它們的優(yōu)缺點(diǎn)。在其它研究中，質(zhì)譜 (MS) 已被證明具有顯著的高靈敏度，但用于常規(guī)原材料的放行檢測(cè)是昂貴的，而且執(zhí)行起來也很麻煩。金納米顆粒表面增強(qiáng)拉曼光譜 (SERS) 已成功用于檢測(cè)蛋白質(zhì)制藥原料中的微量三聚氰胺。最近的一篇綜述提供了一份廣泛的工具清單，其用于生物制藥生產(chǎn)中細(xì)胞培養(yǎng)基的可變性來源檢測(cè)，以及它們的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。表1總結(jié)了這些信息。其它替代方法包括印跡法、毛細(xì)管電泳法(CE)、酶法 (如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA) )、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法和SDS-PAGE。蛋白質(zhì)組學(xué)分析也被提議作為評(píng)估復(fù)雜原材料 (如血清) 的工具。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)用于了解細(xì)胞培養(yǎng)過程中對(duì)生長(zhǎng)特性影響的批次間可變性。作為該方法的延伸，蛋白質(zhì)組學(xué)與代謝組學(xué)相結(jié)合已被用于確定細(xì)胞培養(yǎng)過程中生產(chǎn)力低下的根本原因。該分析將觀察到的細(xì)胞培養(yǎng)性能下降的因素歸結(jié)為由于Cu水平升高 (作為培養(yǎng)基成分中的污染物) 而導(dǎo)致的缺氧。

統(tǒng)計(jì)在數(shù)據(jù)分析中的作用

來自生物制藥生產(chǎn)的數(shù)據(jù)集，包括光譜工具，通常很復(fù)雜，因此單變量或雙變量分析是不充分的，并且可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)論。在大多數(shù)情況下，需要使用多元數(shù)據(jù)分析 (MVDA) 來描述大型多因素和多重共線數(shù)據(jù)集中的相關(guān)信息。MVDA 涉及使用工具進(jìn)行探索性數(shù)據(jù)分析（數(shù)據(jù)挖掘）、分類（聚類分析）、回歸分析和預(yù)測(cè)建模。投影方法通常用于克服數(shù)據(jù)集的多維性、多重共線性、缺失數(shù)據(jù)以及由偏差因素（例如實(shí)驗(yàn)誤差和噪聲）引入的其它變化。一種這樣的技術(shù)是主成分分析 (PCA)，它通過分解數(shù)據(jù)集的協(xié)方差矩陣來找到數(shù)據(jù)集中的主要可變性方向，以用幾個(gè)組件解釋整個(gè)系統(tǒng)的行為。當(dāng)需要探索一個(gè)或多個(gè)響應(yīng)變量的多元相關(guān)性時(shí)，會(huì)使用各種回歸技術(shù)，如主成分回歸、偏最小二乘法 (PLS) 和嶺回歸。PLS 通過減小它們的大小、同時(shí)最大化它們之間的協(xié)方差，來重新排列過程變量空間和響應(yīng)變量空間。原材料庫(kù)的特征數(shù)據(jù)可能包括一個(gè)或多個(gè)分類響應(yīng)變量，這需要使用 PLS 的一種變體，稱為 PLS 判別分析 (PLSDA) 。連續(xù)變量數(shù)據(jù)包含預(yù)測(cè)信息和不相關(guān)信息，使用正交 PLS (OPLS) 可以改進(jìn)模型的診斷和解釋性。基于 PLS 和 PCA 的批量建模常用于生物技術(shù)行業(yè)處理批次操作數(shù)據(jù)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) (DoE) 是規(guī)劃實(shí)驗(yàn)研究的選擇方法，這樣可以使用最少數(shù)量的實(shí)驗(yàn)來獲得相關(guān)的過程信息。它提供了有關(guān)因素相互作用和整個(gè)系統(tǒng)行為方式的信息。它顯示了相互關(guān)聯(lián)的因素如何在一個(gè)廣泛的值范圍內(nèi)響應(yīng)，而不需要直接測(cè)試所有可能的值。因此，它在不影響結(jié)果質(zhì)量的情況下減少了進(jìn)行許多運(yùn)行的工作量和成本。

MVDA為光譜數(shù)據(jù)分析提供了一種有效的方法。應(yīng)用包括預(yù)處理方法，以減少和糾正光譜數(shù)據(jù)中的干擾，如重疊帶、基線漂移、散射和路徑長(zhǎng)度變化。還可采用統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行校準(zhǔn)診斷和變量選擇，統(tǒng)計(jì)結(jié)果計(jì)算以建立具有代表性和可靠性的模型，并對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證和集成，以實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格的預(yù)測(cè)和實(shí)時(shí)的產(chǎn)品質(zhì)量和過程監(jiān)測(cè)。

原材料指紋識(shí)別的最新趨勢(shì)

在最近的研究中，光譜學(xué)和化學(xué)計(jì)量學(xué)的結(jié)合被用來表征原材料的可變性，并根據(jù)原材料的信息預(yù)測(cè)最終產(chǎn)品的質(zhì)量。由于細(xì)胞培養(yǎng)原材料是復(fù)雜的混合物，因此很難識(shí)別和量化存在的每種化合物。拉曼、中紅外、近紅外和熒光等光譜工具與化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合，足以表征復(fù)雜的原材料。NIR 光譜與 PCA 相結(jié)合已被證明可有效地對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基組分進(jìn)行指紋識(shí)別，從而區(qū)分性能好和差的培養(yǎng)基批次。在 Lee 等人最近的另一項(xiàng)研究中，分析了多個(gè)大豆水解產(chǎn)物批次的 NIR 光譜，并通過使用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法表明，NIR 光譜可用于揭示批次之間以及供應(yīng)商之間的差異。利用近紅外光譜建立了基于偏最小二乘回歸(PLSR)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物生長(zhǎng)和產(chǎn)率預(yù)測(cè)模型。

此外，在確定新原材料對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)性能的影響時(shí)，評(píng)估多個(gè)光譜平臺(tái)的性能是很重要的。有研究表明，近紅外光譜和2D熒光光譜都可以檢測(cè)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的成分變化，發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的老化會(huì)影響細(xì)胞培養(yǎng)性能，因此近紅外光譜和2D熒光光譜都可以評(píng)估基礎(chǔ)培養(yǎng)基儲(chǔ)存后的質(zhì)量。另一項(xiàng)類似的研究表明，近紅外和2D熒光光譜能夠檢測(cè)培養(yǎng)基成分的批次差異。

QbD范式下原材料管理的案例研究。(a) 多變量數(shù)據(jù)分析表明臨床生產(chǎn) (組2) 和商業(yè)化生產(chǎn) (組1) 存在差異。(b) 根本原因分析表明基礎(chǔ)培養(yǎng)基的差異是工藝可變性的主要來源。(c) 基于近紅外光譜的原材料指紋識(shí)別方法的開發(fā)。(d) 近紅外光譜法能夠區(qū)分“好” (組B) 和“壞”(組A)的批次。

研究人員認(rèn)為，在很多情況下，單一光譜可能不足以表征原材料，可能需要結(jié)合多種正交光譜技術(shù)來實(shí)現(xiàn)所需的特異性和準(zhǔn)確性。已經(jīng)提出了光譜和非光譜技術(shù)的多種組合來表征復(fù)雜的原材料。研究人員已經(jīng)展示了使用氣相色譜-質(zhì)譜分光光度法 (GC-MS) 方法對(duì)復(fù)雜的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基中的脂質(zhì)進(jìn)行微量定量，確定為脂肪酸甲酯 (FAME) 。其他研究人員建議結(jié)合使用親和層析（Protein G 或Protein A）、SDS-PAGE 和肽質(zhì)量指紋圖譜來分析細(xì)胞培養(yǎng)基中是否存在污染性牛抗體。液相色譜-質(zhì)譜 (LC-MS) 技術(shù)也已應(yīng)用于多種培養(yǎng)基成分的同步定量。最近，研究還探索了基于化學(xué)計(jì)量學(xué)的數(shù)據(jù)融合方法，以支持的不同光譜工具的組合。在一項(xiàng)這樣的研究中，多個(gè)光譜平臺(tái)（NIR、拉曼、熒光和 X 射線熒光）在估計(jì)能力方面相互比較，然后集成到一個(gè)統(tǒng)一的預(yù)測(cè)模型中。結(jié)果表明，數(shù)據(jù)融合模型比單獨(dú)的光譜方法表現(xiàn)出更好的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，證明了數(shù)據(jù)融合在表征原材料質(zhì)量方面的協(xié)同效應(yīng)。

原材料指紋識(shí)別的案例研究

來自一家大型生物技術(shù)公司的研究人員報(bào)告了一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)從臨床規(guī)模 (2,000 L)到商業(yè)化規(guī)模(15,000 L)的技術(shù)轉(zhuǎn)移和規(guī)模放大過程中面臨的重大問題。該案例研究如圖2所示。商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的產(chǎn)品的CQA與臨床規(guī)模生產(chǎn)的CQA有顯著差異。進(jìn)行了廣泛的調(diào)查，以確定根本原因。根本原因被確定為同一供應(yīng)商為兩種操作規(guī)模提供的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的差異。在供應(yīng)商現(xiàn)場(chǎng)的進(jìn)一步調(diào)查得出的信息是，在碾磨和混合過程中，培養(yǎng)基成分的分組隨生產(chǎn)規(guī)模和培養(yǎng)基類型而變化，從而產(chǎn)生不同的特征。考慮到原材料的顯著影響，基于對(duì)工藝性能和產(chǎn)品屬性的影響，創(chuàng)建了一種基于近紅外的方法來篩選大量基礎(chǔ)培養(yǎng)基粉末。結(jié)合NIR/MVDA方法可以對(duì)原材料進(jìn)行指紋識(shí)別，以區(qū)分表現(xiàn)良好和表現(xiàn)不佳的培養(yǎng)基批次。

總結(jié)

監(jiān)管反饋導(dǎo)致生物制藥行業(yè)對(duì)原材料及其管理的看法發(fā)生了重大轉(zhuǎn)變。大多數(shù)主要制造商正在應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)分析和良好科學(xué)的原則來確定關(guān)鍵原材料及其分析特性。在過去十年中，對(duì)關(guān)鍵原材料進(jìn)行準(zhǔn)確指紋識(shí)別的概念也得到了發(fā)展。本文中提出的在QbD范式中逐步管理原材料的方法可能會(huì)大大提高我們對(duì)該主題的理解。盡管在過去十年中已經(jīng)取得了很多成就，但我們?cè)谠牧媳碚鞣矫嫒匀贿h(yuǎn)遠(yuǎn)沒有達(dá)到與我們?cè)诠に嚤碚鞣矫嫦嗤膰?yán)格程度。不斷向系統(tǒng)中添加新的原材料將使這項(xiàng)任務(wù)仍具挑戰(zhàn)性。

原文：A.S.Rathore, D.Kumar, N. Kateja, Role of raw materials in biopharmaceutical manufacturing: risk analysis and fingerprinting. Current Opinion in Biotechnology, 2018.

內(nèi)容來源：生物工藝與技術(shù) 責(zé)任編輯：胡靜 審核人：何發(fā)

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